一、認識冠狀病毒

 

冠狀病毒是一個大型病毒家族,因該病毒形態在電鏡下觀察類似王冠而得名。目前為止發現，冠狀病毒僅感染脊椎動物，可引起人和動物呼吸道、消化道和神經系統疾病，如感冒以及中東呼吸綜合征(MERS)和嚴重急性呼吸綜合征(SARS)等較嚴重疾病。

 

 

眾所周知，新型冠狀病毒潛伏期為14天，當出現呼吸困難、乏力、高燒等現象，應當盡早報備相關機構，盡早提取標本進行檢驗篩查。相信大家都很好奇,新冠病毒是如何被檢測出來的呢?

 

二、新冠病毒核酸檢測流程

 

采取咽拭子樣本，送到檢驗醫學中心,實驗室內會為核酸檢測準備4個區域，分別是試劑準備區、樣本準備區、擴增區、擴增產物分析區。

 

其中試劑準備區負責接收患者樣本，樣本準備區則負責進行對樣本的核酸進行提取，擴增區則是擴增復制核酸樣本，擴增后分析區就是分析樣本內核酸能能否與標準樣配對，通過儀器檢測的到，就判斷成陽性，如果檢測不到就是陰性。

 

三、認識PCR實驗室

 

PCR(聚合酶鏈式反應)實驗室又叫基因擴增實驗室，是一種分子生物學技術,用于放大特定的DNA片段，可看作生物體外的特殊DNA復制。通過DNA基因追蹤系統,能迅速掌握患者體內的病毒含量，其精確度高達納米級別，精確檢測新型冠狀病毒在患者體內存在的數量、是否復制、是否傳染、傳染性有多強、是否必要服藥、肝功能有否異常改變能及時判斷病人最適合使用哪類抗病毒藥物、判斷藥物療效如何、給臨床治療提供了可靠的檢驗依據。

 

PCR實驗室分類：普通PCR實驗室、全自動定量PCR實驗室、一體自動化分析PCR實驗室。

 

四、PCR實驗室的四個分區

 

01、試劑準備區

 

功能作用：試劑準備區是PCR實驗室中最為“潔凈”的區域，它不應有任何核酸成分的存在，否則將嚴重影響檢測結果的準確性。標本的制備應在生物安全柜內進行。

 

主要設備：冰箱、低溫冰箱、混勻器、微量加樣器(0.2-1000ul)、移動紫外燈。

 

02、樣本準備區

 

功能作用：核酸提取、貯存，擴增反應管制作。

 

主要設備：冰箱、超低溫冰箱、高速冷凍離心機、混勻器、微量加樣器(0.2-1000ul)、移動紫外燈、水浴鍋、生物安全柜。

 

03、擴增區

 

功能作用：擴增反應體系的配置和核酸的提取加入要在擴增區內進行。

 

主要設備：擴增儀、離心機、微量加樣器(0.2-1000ul)、移動紫外燈。

 

生物安全柜內操作

 

04、擴增產物分析區

 

功能作用：產物分析區最后一個工作區域，用于擴增片段的分析，由于本工作區域應設置為負壓狀態,空氣流向為由外向內，以防止擴增產物的氣溶膠的流出(一般四個分區皆設置緩沖間)。

 

主要設備：凝膠成像分析儀、電泳儀、電泳槽、微量加樣器(0.2-1000ul)、移動紫外燈。

 

即：試劑準備區→樣本準備區→擴增區→擴增產物分析區。

 

PCR 實驗室的各個實驗區域之間應形成單向工藝流、物流、人流與氣流，實現單向流程的屏障保護。通過嚴格的單向流線，避免實驗之間的相互干擾和交叉污染，防止核酸氣溶膠對實驗過程造成污染，產生假性結果。

 

避免交叉感染

 

PCR實驗室的氣流壓差原理及控制：

 

1、試劑準備區是工藝流線的開始，設計為正壓或常壓,避免外界環境的污染。

 

2、樣品準備區一般為常壓或負壓，大多數情況下設計成二級生物安全實驗室,避免實驗產物溢出,污染外界環境。

 

3、擴增區為負壓，避免實驗產物溢出，污染外界環境。

 

4、擴增產物分析區是最主要的擴增產物污染來源，通常壓力設計為最低，避免實驗產物溢出，污染外界環境。

 

供參考

 

五、PCR實驗室的設計

 

PCR實驗室的送排風設計及排放準則:

 

1、氣流組織宜采用上送下排;

 

2、生物安全柜上方不得設計送風口;

 

3、高效過濾排風口應設計在實驗室內污染最嚴重的區域，且為單向;

 

4、不得循環送排風。

 

PCR實驗室排風應有效處理達標后在2m以上高空進行排放。

 

怎么定義為陽性?

 

20世紀70年代以來，國際上統一了冠狀病毒的命名，了解了病毒的基因結構和部分功能，研究出好幾種可識別病毒生長的指標，只有定下指標,才能檢測你是陽性陰性。

 

那么“新冠病毒”是怎么被定義為陽性的?

 

“新冠病毒陽性”要確認這一點，必須從樣本(比如痰、汗液、血液、糞便等等)里提取出完整的病毒。在這次疫情暴發之初,我們有聽到一些新聞所謂“分離出病毒株”，大概指的就是這個。

 

這個操作挺麻煩的，并且不是每一次都能分離成功。只能作為“確實有病毒在這里”的絕對證據。但作為給患者的檢測，既慢，又不夠準確。因此，現在我們聽到更多的，是“新冠病毒核酸檢測陽性”。

 

所謂“新冠病毒核酸檢測陽性”，又是怎么來的呢? 首先,提取樣本。就是把痰啊、咽拭子采到的東西啊、糞便啊等等，先想辦法收起來，拿到實驗室把樣本里面的核酸(就新冠病毒而言，指RNA)提取出來。RNA提取之后，降解速度非常快。因此，其實我們需要把RNA再對應的轉成為cDNA。

 

接下來的過程，本質叫做PCR(聚合酶鏈式反應)。大致意思就是用特別的標簽，把新冠病毒最特征的那一段信息(原本是RNA信息,此時已經對應轉換成為cDNA信息)給識別出來。不只是識別，這個過程是在識別的基礎上，反復的復制這一段。那么經過一段時間，原來在樣本里只有一點點的信息，就被擴增到很多了，也就容易查到了。

 

 

檢測用到的，叫做realtimePCR。啥意思呢？就是說病毒的核酸信息每一次被復制都會被記錄下來。這樣檢測更準確。并且,理論上說,甚至可以推斷出樣本里面的病毒核酸的密度。

 

如果樣本里面沒有病毒核酸,那么那個尋找病毒信息的標簽,就永遠也找不到落點。這時候當然不可能有任何東西被復制出來,那么檢測結果就是陰性。

 

如果樣本里面有病毒核酸,那么標簽就可以找到它,并且復制它,然后發出信號告訴檢測者:這里有病毒。這,就是核酸檢測陽性。

 

然而,當樣本里的病毒核酸數量特別少的時候,標簽可能找不到……這就會造成檢測的假陰性。

 

如果標簽的靈敏度不夠，也會出現找不到病毒核酸的情況。這也會造成檢測的假陰性。某些患者檢測若干次都是陰性，最后才發現是陽性。

簡單來說，就是有可能是取樣的時候沒有取到病毒最多的地方，或者當時患者體內的病毒確實不多，或者檢測的試劑靈敏度不夠。

 

當然，還有其他諸如環境因素、儀器問題等等的原因。要知道,任何檢測手段都是有局限的，偶爾的例外并不是稀罕事。另外，因為目前對于新冠的了解不到位，檢測不能一步到位，這也確實是現實。